客戶背景
桔梗（Platycodon grandiflorus）是一種廣泛應(yīng)用于抗炎、抗腫瘤和認(rèn)知增強(qiáng)的藥用植物，其生物活性主要來源于三萜皂苷，如桔梗皂苷D（PD）和桔梗皂苷D3（PD3）。安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)在《International Journal of Molecular Sciences》發(fā)表的研究（DOI：10.3390/ijms26104832）鑒定出桔梗中107個(gè)UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶（UGT）基因，其中PgUGT29催化PD向PD3的糖基化反應(yīng)，這是皂苷生物合成的關(guān)鍵步驟。該研究為藥用植物活性化合物的代謝工程提供了基礎(chǔ)。

客戶需求
研究需要在大腸桿菌中異源表達(dá)并純化PgUGT29和PgUGT72蛋白，以驗(yàn)證其酶活性，同時(shí)開發(fā)特異性抗體，研究蛋白相互作用并確認(rèn)PD在C3位的糖基化活性，為闡明皂苷生物合成途徑提供支持。

技術(shù)挑戰(zhàn)
1. 蛋白表達(dá)與純化：植物來源的UGT蛋白（如PgUGT29和PgUGT72）在大腸桿菌中常表現(xiàn)為低溶解性和錯(cuò)誤折疊，需優(yōu)化表達(dá)條件和重折疊策略，以實(shí)現(xiàn)高純度（>95%）和功能活性。
2. 抗體特異性：開發(fā)針對(duì)PgUGT29的抗體需設(shè)計(jì)特異性表位抗原，確保高特異性和低交叉反應(yīng)性，這對(duì)Western blot和免疫熒光等復(fù)雜實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確檢測(cè)至關(guān)重要。
3. 功能驗(yàn)證：確保重組UGT蛋白在體外實(shí)驗(yàn)（如HPLC糖基化實(shí)驗(yàn)）中保持酶活性，并保證抗體在分子研究中精確檢測(cè)目標(biāo)蛋白，需要嚴(yán)格的質(zhì)量控制和驗(yàn)證。

技術(shù)服務(wù)解決方案
普健生物為桔梗UGT研究提供定制蛋白表達(dá)和抗體開發(fā)服務(wù)：
1. 重組PgUGT表達(dá)與純化：
(1) 使用IPTG誘導(dǎo)（1 mM，37°C，4小時(shí)）在大腸桿菌BL21（DE3）中表達(dá)His標(biāo)簽的PgUGT29和PgUGT72，通過Ni-NTA親和層析和尿素透析重折疊，獲得純度>95%、濃度為0.21–0.50 mg/mL的蛋白，經(jīng)SDS-PAGE和Western blot驗(yàn)證。
(2) 采用Bradford法量化蛋白，滿足HPLC酶活性測(cè)試需求。
2. 抗PgUGT29抗體定制與驗(yàn)證：
(1) 設(shè)計(jì)針對(duì)PgUGT29特異性表位（例如PSPG基序區(qū)域）的抗原，生產(chǎn)兔源多克隆抗體，通過Western blot和免疫熒光驗(yàn)證其特異性，確保在植物組織中準(zhǔn)確檢測(cè)PgUGT29。
(2) 在4–6周內(nèi)交付抗體，符合項(xiàng)目時(shí)間要求。
3. 功能驗(yàn)證支持：
(1) 提供基于HPLC的酶活性實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)PgUGT29以UDP-Glc為供體催化PD向PD3的轉(zhuǎn)化，采用PgUGT72作為陰性對(duì)照以確保特異性。
(2) 支持分子對(duì)接研究，識(shí)別UDP-Glc結(jié)合的關(guān)鍵殘基（如T145、D392、Q393、N396），加深對(duì)酶-底物相互作用的理解。

我們的蛋白表達(dá)和抗體定制服務(wù)成功實(shí)現(xiàn)了PgUGT29和PgUGT72的表達(dá)與純化，HPLC驗(yàn)證確認(rèn)PgUGT29催化PD向PD3的轉(zhuǎn)化。抗PgUGT29抗體展現(xiàn)出高特異性，精準(zhǔn)檢測(cè)目標(biāo)蛋白，支持了功能研究的順利開展。這些成果為闡明桔梗皂苷生物合成途徑提供了重要支持，推動(dòng)了藥用皂苷（如PD3）在藥物開發(fā)中的代謝工程應(yīng)用，顯著提高了其潛在產(chǎn)量。

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