神經(jīng)病理性疼痛（neuropathic pain, NP）是一種由外周或中樞神經(jīng)損傷引起的慢性頑固性疼痛，常伴隨焦慮、抑郁等情緒障礙。其發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，涉及神經(jīng)元興奮性改變、突觸可塑性異常以及多層次的基因表達(dá)調(diào)控。近年研究顯示，RNA甲基化等表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)修飾在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有重要作用，其中m?Am修飾位于mRNA 5′端帽結(jié)構(gòu)鄰近的腺苷，影響mRNA穩(wěn)定性與翻譯效率, 對慢性疼痛可能具有重要影響。已知PCIF1是催化m?Am修飾的關(guān)鍵甲基轉(zhuǎn)移酶，Serpine1 mRNA結(jié)合蛋白1（SERBP1）是一種具有伴侶功能的mRNA結(jié)合蛋白，在mRNA穩(wěn)定性、神經(jīng)發(fā)生和突觸形成中發(fā)揮重要作用。然而，PCIF1/SERBP1以及m6Am在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生中的作用尚不清楚。

PCIF1在神經(jīng)損傷后顯著上調(diào)，特異分布于S1HL興奮性神經(jīng)元

       針對上述問題，作者采用多種神經(jīng)病理性疼痛動物模型（SNI、CCI、化療或2型糖尿病模型等）進(jìn)行系統(tǒng)研究。在坐骨神經(jīng)結(jié)扎（SNI）小鼠模型中，m?Am修飾水平在對側(cè)初級軀體感覺皮層后肢區(qū)（S1HL）顯著升高，伴隨PCIF1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。免疫染色顯示，該上調(diào)主要發(fā)生在S1HL第5層興奮性神經(jīng)元，而在炎癥性疼痛和慢性應(yīng)激模型中，PCIF1水平未見明顯變化。這提示外周神經(jīng)損傷特異性誘導(dǎo)了對側(cè)S1HL中PCIF1蛋白的上調(diào)，這可能是m6Am水平升高的原因。PCIF1的變化是神經(jīng)損傷特異性反應(yīng)。

Fig. 1 神經(jīng)病痛導(dǎo)致S1HL中m6Am和PCIF1蛋白水平升高

       細(xì)胞分型分析顯示，PCIF1的上調(diào)主要局限于S1HL區(qū)域第5層的谷氨酸能（興奮性）神經(jīng)元。免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果表明，PCIF1主要表達(dá)于神經(jīng)元，而在小膠質(zhì)細(xì)胞中無明顯分布。進(jìn)一步利用特異性標(biāo)記不同層興奮性和抑制性神經(jīng)元的小鼠模型結(jié)合單細(xì)胞RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，SNI后PCIF1的表達(dá)升高僅發(fā)生在對側(cè)第5層的興奮性神經(jīng)元中，其他層的興奮性神經(jīng)元及各層的抑制性神經(jīng)元均未出現(xiàn)明顯變化。激光捕獲微區(qū)分離的結(jié)果同樣支持這一定位結(jié)論。

抑制PCIF1可緩解疼痛行為與神經(jīng)元過度興奮

       為探究S1HL興奮性神經(jīng)元中PCIF1上調(diào)的功能意義，研究團(tuán)隊在該類神經(jīng)元中特異性敲低PCIF1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這不僅阻斷了神經(jīng)損傷后PCIF1蛋白的升高，還顯著減輕了機(jī)械性和熱性疼痛敏感，說明PCIF1的上調(diào)對神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生至關(guān)重要。進(jìn)一步結(jié)合在體鈣成像與腦片電生理發(fā)現(xiàn)，PCIF1缺失可消除神經(jīng)損傷引起的神經(jīng)元Ca²?信號增強(qiáng)及放電頻率升高，提示其在維持興奮性神經(jīng)元過度活化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

Fig. 2 S1HLGu PCIF1的增加對于神經(jīng)性疼痛的誘導(dǎo)和維持是必需的

       為了驗證PCIF1上調(diào)是否足以引發(fā)疼痛狀態(tài)，研究團(tuán)隊在未受神經(jīng)損傷的正常小鼠S1HL興奮性神經(jīng)元中過表達(dá)PCIF1。結(jié)果顯示，這些小鼠在無外周神經(jīng)損傷的情況下，仍出現(xiàn)了類似神經(jīng)病理性疼痛的行為，包括痛覺過敏、熱痛閾降低及焦慮樣表現(xiàn)，并且在條件性安慰偏好實(shí)驗中呈現(xiàn)自發(fā)性疼痛跡象。這一效應(yīng)在運(yùn)動皮層過表達(dá)PCIF1時未出現(xiàn)，提示S1HL是該作用的關(guān)鍵區(qū)域。

Fig. 3 上調(diào)S1HLGluPCIF1誘導(dǎo)神經(jīng)性疼痛樣行為

PCIF1過表達(dá)可直接誘發(fā)疼痛表型

       在細(xì)胞水平上，PCIF1上調(diào)顯著增強(qiáng)了S1HL興奮性神經(jīng)元的興奮性。無損傷小鼠在S1HL同時注射AAV-DIO-Pcif1和AAV-DIO-GCaMP6s后，面部疼痛刺激可引發(fā)更強(qiáng)的Ca²?信號反應(yīng)。腦片記錄結(jié)果也顯示，這些神經(jīng)元在去極化刺激下的放電頻率顯著高于對照組。這些結(jié)果表明，PCIF1升高可直接促進(jìn)興奮性神經(jīng)元的去極化響應(yīng)與放電活動，從而可能驅(qū)動疼痛中樞的異常興奮。

Fig. 4 PCIF1升高可直接驅(qū)動疼痛中樞的異常興奮

PCIF1與SERBP1在神經(jīng)損傷后形成增強(qiáng)的復(fù)合體

       為探究PCIF1在神經(jīng)元中的作用機(jī)制，研究者利用內(nèi)源性PCIF1免疫共沉淀結(jié)合定量質(zhì)譜，鑒定出SERBP1是PCIF1的主要互作蛋白。在細(xì)胞系和小鼠模型中均證實(shí)，兩者可形成復(fù)合體，其結(jié)合在神經(jīng)損傷后顯著增強(qiáng)，而PCIF1下調(diào)可阻斷這一增強(qiáng)。這些結(jié)果說明，PCIF1與SERBP1在神經(jīng)元中協(xié)同工作，通過形成復(fù)合體介導(dǎo)特定mRNA的m?Am修飾，從而實(shí)現(xiàn)對神經(jīng)元功能的選擇性調(diào)控。

Fig. 5 SERBP1和PCIF1相互作用并共同催化mRNA上的m6Am修飾

    在本研究中，所用的SERBP1蛋白由AtaGenix采用昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)定制生產(chǎn)，為驗證蛋白互作和下游功能提供了核心試劑支持。

靶mRNA的m?Am修飾變化及功能后果

       接著，為確定PCIF1–SERBP1復(fù)合體的下游作用靶點(diǎn)，研究人員結(jié)合m?Am-Exo-Seq和RNA免疫共沉淀測序，篩選出多個候選基因，其中Maf1（RNA聚合酶III抑制因子）mRNA最為顯著，Maf1編碼的蛋白參與神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)調(diào)控。實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，外周神經(jīng)損傷后，S1HL中Maf1 mRNA的m?Am修飾水平顯著升高，而在興奮性神經(jīng)元中敲除PCIF1可完全阻斷這一變化。

Fig. 6 S1HL 中 Maf1 基因上 m6Am 峰

       進(jìn)一步檢測顯示，SNI會增強(qiáng)PCIF1與Maf1 mRNA的結(jié)合，而PCIF1缺失可消除這一增強(qiáng)。此外，下調(diào)SERBP1同樣能抑制Maf1 mRNA的m?Am水平升高，提示SERBP1參與該修飾過程。結(jié)果表明，在神經(jīng)損傷條件下，PCIF1–SERBP1復(fù)合體促進(jìn)了Maf1 mRNA的m?Am修飾，從而可能影響神經(jīng)元功能。

PCIF1–SERBP1復(fù)合體通過m?Am修飾調(diào)控Maf1 mRNA

       MeRIP-seq與驗證實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，Maf1 mRNA是PCIF1–SERBP1復(fù)合體的主要修飾靶點(diǎn)。SNI模型中，Maf1 mRNA的m?Am水平顯著升高，同時Maf1蛋白表達(dá)下降。敲低PCIF1或SERBP1均可阻斷這一變化，表明二者協(xié)同介導(dǎo)了靶mRNA的修飾。

Fig. 7 增加的PCIF1導(dǎo)致SNI誘導(dǎo)的MAF1在S1HL中的下調(diào)

MAF1功能驗證

       下調(diào)MAF1可在正常小鼠中模擬PCIF1過表達(dá)的疼痛和神經(jīng)元興奮表型，而恢復(fù)MAF1表達(dá)則部分逆轉(zhuǎn)PCIF1上調(diào)所致的行為學(xué)和電生理變化。這證實(shí)了MAF1是PCIF1–SERBP1–m?Am修飾通路的關(guān)鍵功能下游。

       在未受損的小鼠中，AAV介導(dǎo)的shRNA敲低MAF1可引發(fā)機(jī)械性和熱痛敏感，同時伴隨S1HL神經(jīng)元鈣信號反應(yīng)增強(qiáng)及自發(fā)放電頻率升高，說明MAF1下降本身即可驅(qū)動疼痛相關(guān)神經(jīng)功能變化。在PCIF1過表達(dá)模型中，AAV恢復(fù)MAF1表達(dá)可明顯緩解疼痛敏感性，并降低神經(jīng)元的過度鈣反應(yīng)與放電頻率。這些結(jié)果表明，MAF1在PCIF1–SERBP1–m?Am通路中具有關(guān)鍵抑制作用，可限制神經(jīng)元過度興奮并緩解疼痛狀態(tài)。

Fig. 8 S1HLGlu神經(jīng)元中的SERBP1-PCIF1復(fù)合體如何參與神經(jīng)性疼痛和并發(fā)焦慮的發(fā)育與維持

       總的來說，這項研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)性疼痛合并焦慮的小鼠模型中，初級軀體感覺皮層后肢區(qū)（S1HL）第5層興奮性神經(jīng)元內(nèi)，PCIF1特異性上調(diào)并與SERBP1結(jié)合，促進(jìn)Maf1 mRNA 5′端m6Am修飾沉積，從而抑制MAF1蛋白表達(dá)，增強(qiáng)神經(jīng)元興奮性并引發(fā)疼痛和焦慮樣行為。提示SERBP1–PCIF1–MAF1通路是神經(jīng)性疼痛與焦慮的重要分子機(jī)制和潛在治療靶點(diǎn)。

       普健生物（AtaGenix）為研究團(tuán)隊提供了高純度、高生物活性的重組SERBP1蛋白，用于體外m6Am催化實(shí)驗來驗證SERBP1在PCIF1介導(dǎo)的m6Am修飾中的作用。SERBP1蛋白由桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)，經(jīng)過嚴(yán)格質(zhì)控，確保了實(shí)驗的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。

       截至目前，已有400余篇文獻(xiàn)引用了普健生物的一站式蛋白抗體開發(fā)技術(shù)服務(wù)。展望未來，普健生物將繼續(xù)全力支持科研工作，推動技術(shù)創(chuàng)新與突破。為感謝大家的持續(xù)支持，普健生物將一如既往地提供高質(zhì)量的服務(wù)，我們的文獻(xiàn)獎勵活動也將長期有效。凡是在發(fā)表的論文中引用普健生物的技術(shù)服務(wù)并標(biāo)注：

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